三维细胞培养生物材料及其在肿瘤组织工程研究中的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.42.021

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (42): 6371-6377.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.42.021

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三维细胞培养生物材料及其在肿瘤组织工程研究中的应用

韩小东1，王磊2，郑军2，贺小龙2，吉金山1，符兆英1

1延安大学，陕西省延安市 716000；2延安大学附属医院，陕西省延安市 716000

收稿日期:2016-07-25 出版日期:2016-10-14 发布日期:2016-10-14
通讯作者: 符兆英，教授，延安大学，陕西省延安市 716000
作者简介:韩小东，男，1982年生，陕西省横山县人，汉族，西安交通大学在读博士，讲师，主治医师，主要从事中药药理，临床麻醉研究。并列第一作者：王磊，男，西安交通大学在读博士，主治医师，主要从事骨科方面的研究。

Three-dimensional scaffold materials for cell culture and their application in tumor tissue engineering

Han Xiao-dong1, Wang Lei2, Zheng Jun2, He Xiao-long2, Ji Jin-shan1, Fu Zhao-ying1

1Yanan University, Yan’an 716000, Shaanxi Province, China; 2Affiliated Hospital of Yanan University, Yan’an 716000, Shaanxi Province, China

Received:2016-07-25 Online:2016-10-14 Published:2016-10-14
Contact: Fu Zhao-ying, Professor, Yanan University, Yan’an 716000, Shaanxi Province, China
About author:Han Xiao-dong, Studying for doctorate, Lecturer, Attending physician, Yanan University, Yan’an 716000, Shaanxi Province, China Wang Lei, Studying for doctorate, Attending physician, Affiliated Hospital of Yanan University, Yan’an 716000, Shaanxi Province, China Han Xiao-dong and Wang Lei contributed equally to this work.

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
三维细胞培养技术：是指将细胞培养于具有三维结构的载体，使细胞在载体的三维空间结构中迁移、生长，形成细胞-载体三维复合物，以利于更好地模拟体内细胞微环境，在组织工程等研究领域已成为标准模式。
三维细胞培养的优势：更接近细胞的体内状态；能够提高细胞因子、抗体及其他生物分子等的产量；能够改进细胞培养效率，细胞在三维环境中比在二维环境中生长更健康；实验数据更可靠，如基因表达谱、细胞活动等与体内研究的数据更吻合；能够降低新药研发的成本和周期；可替代一部分动物实验，而且在三维细胞培养系统中，可使用人类细胞作为研究对象，而不像动物实验那样，研究对象是动物细胞。

摘要
背景：利用三维细胞培养技术可以更好地模拟细胞微环境，为组织工程研究领域提供新的手段。
目的：分析三维细胞培养中生物材料的选择和应用特点及其在肿瘤组织工程中的应用。
方法：应用计算机检索检索万方数据库、PubMed数据库1998至2015年的相关文献，中文检索关键词为“三维培养，支架材料，细胞生长，肿瘤组织工程”，英文检索关键词为“Three Dimensional Cultures，Scaffold，cell differentiation，tumor tissue engineering”。
结果与结论：三维支架材料的选择和应用是三维技术的关键之一。迄今为止，支架材料如胶原凝胶、明胶海绵、琼脂糖、壳聚糖、脱钙骨基质等尽管能为种子细胞提供三维空间环境，却无法提供类似细胞外基质的微环境，使种子细胞的生长及增殖受到影响，分泌Ⅱ型胶原和糖胺聚糖等细胞外基质的能力明显下降。在支架材料中，仿生支架材料因其创伤小、可塑性强而逐渐显示出其独特的优越性。三维培养条件上调了肿瘤细胞促血管发生生长因子的分泌量，这一特性同体内肿瘤的血管发生正相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-9442-1700(韩小东)

关键词: 组织构建, 组织工程, 三维细胞培养, 支架材料, 微环境, 肿瘤组织工程, 细胞生长

Abstract:

BACKGROUND: The use of three-dimensional cell culture techniques can better simulate the cellular microenvironment, providing new tools for tissue engineering research.
OBJECTIVE: To analyze the biomaterial selection and application characteristics in three-dimensional cell culture as well as applications in tumor tissue engineering.
METHODS: We searched Wanfang database and PubMed database 1998-2015 years for relevant literature using keywords of “three-dimensional cultures; scaffold; cell growth; cell differentiation; tumor tissue engineering” in Chinese and English, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: The selection and application of three-dimensional scaffold materials is one of the keys. So far, scaffold materials, such as collagen gels, gelatin sponge, agarose, chitosan, demineralized bone matrix, cannot provide the extracellular matrix similar to the micro-environment in which seed cell growth and proliferation are not affected, and the ability to secrete type II collagen and glycosaminoglycan is decreased, although they can provide three-dimensional space for seed cells. Biomimetic scaffold characterized as little trauma and strong plasticity gradually shows its unique advantages. Three-dimensional culture conditions raise pro-angiogenic growth factor secretion from tumor cells, and this feature is positively correlated with the occurrence of in vivo tumor angiogenesis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Stents, Tumor Microenvironment, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

韩小东，王磊，郑军，贺小龙，吉金山，符兆英 . 三维细胞培养生物材料及其在肿瘤组织工程研究中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(42): 6371-6377.

Han Xiao-dong1, Wang Lei2, Zheng Jun2, He Xiao-long2, Ji Jin-shan1, Fu Zhao-ying1. Three-dimensional scaffold materials for cell culture and their application in tumor tissue engineering[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(42): 6371-6377.

图/表（结果） 1

2.1 三维细胞培养支架材料应用以往大部分细胞都是应用二维细胞培养，但在体内，细胞则被其他细胞、组织和细胞外基质重重包围，于是，研究人员开始尝试三维细胞培养，并观察它与二维培养的差异，包括基因表达、信号转导、细胞增殖、细胞形态、细胞间相互作用及药物反应的改变。越来越多的证据表明，在三维培养系统中生长的细胞会表现出更生理的表型、相互作用及反应。因此，当结果的生理相关性很重要，或者无法通过其他方式来准确重现细胞行为时，或许应该考虑向三维转换^[13-14]。卢华定等^[15]研究结果证实，软骨细胞在体外单层培养会失去细胞表型，不能分泌Ⅱ型胶原，高密度培养能减缓该过程。而在Ⅰ型胶原三维立体支架中培养，有利于维持软骨细胞的表型及分泌Ⅱ型胶原的功能。因此，建议采用在三维立体支架内高密度培养软骨细胞,具有重要的临床意义。

2.1.1 胶原三维培养支架材料三维细胞培养以常见支架三维培养模型为主，该模型能更好地模拟细胞在体内的生长自然环境。目前，建立三维细胞培养体系是组织工程肿瘤的研究热点，不同的组织细胞对三维结构载体的要求条件存在差异^[16-17]。然而目前培养细胞和组织的方法多局限于二维培养研究，三维培养因没有理想的支架材料而进展缓慢。胶原蛋白是肿瘤细胞外基质的主要成分，直接或间接的参与肿瘤细胞各种生命活动，所以研究人员利用胶原支架材料建立肿瘤细胞三维培养体系。胶原蛋白种类较多，常见类型为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型胶原蛋白，由于其具有良好的生物学特性，已成为细胞三维培养常用的支架材料。蔡国徽等^[18]研究发现胶原Ⅰ具有良好的结构与性能，适宜于卵巢癌细胞体外三维培养，并能较好地维持卵巢癌细胞的形态和功能。黄俏莹等^[19]将前列腺癌PC3细胞接种到4种支架材料中进行三维培养，结果显示采用支架材料的三维培养体系优于不用支架材料的二维培养体系，胶原为体外前列腺癌PC3细胞三维培养的最优支架材料。

胶原水凝胶三维细胞培养是在传统二维细胞培养的基础上，以胶原水凝胶或者固体支架的形式增加一个维度，使细胞像在体内一样生长在三维空间里。胶原水凝胶作为三维细胞培养支架材料，不但对细胞提供张力支持，而且胶原水凝胶的成分也是细胞信号的来源。这是因为胶原水凝胶的成分里含有细胞外基质相关蛋白，如胶原质，这些蛋白不但提供张力支持，而且是细胞表面受体的配体；胶原水凝胶的坚实度可以调节，可通过调节成分组成及成分配比来实现；胶原水凝胶的组分来自自然提取物，可被细胞分泌的酶所降解，更能模拟体内细胞的生长状况；胶原水凝胶提供给细胞一个完全自由的三维空间，因此生长在胶原水凝胶中的细胞才能充分展示它在体内的生长习性^[20-26]。例如乳腺表皮细胞在胶原水凝胶中聚集形成被称为微组织的球状结构，准确模拟了该细胞种类在体内的生长状况。刘劲松^[27]研究发现，肝细胞在壳聚糖/胶原水凝胶支架中培养10 d后形成三维的聚集细胞团；肝细胞在水凝胶支架中生长速度略慢于二维平面培养，但在三维体系下肝细胞能长时间保持细胞活性；肝细胞在水凝胶支架中三维生长后，纤维蛋白骨架发生重排，结构与在体肝组织更接近；在水凝胶支架中的三维肝肿瘤细胞模型对化疗药物的敏感性降低。由此可见，在壳聚糖/胶原水凝胶支架中形成的三维肝肿瘤模型，其细胞骨架结构更接近体内肝组织，因此可用于体外药筛模型研究。

2.1.2 丝素蛋白三维培养支架材料丝素蛋白是目前被认可的有机高分子支架材料，具有良好的组织及细胞相容性、无毒害、可再生性等特点。前期动物急性毒性实验、体外细胞毒性实验等研究证实，利用静电纺丝方法制作出来的丝素蛋白/左旋聚乳酸支架材料具备良好的生物相容性。进一步的倒置显微镜观察显示，丝素蛋白/壳聚糖支架上的细胞看不清，随着时间的延长，支架周围细胞增多且有细胞伸入支架内；细胞不仅可以在材料表面贴附生长，并伸入材料之中^[28]。说明细胞黏附率随时间的延长而增加，丝素蛋白/壳聚糖混合支架材料具有良好的细胞相容性。

水凝胶是良好的细胞外基质材料，特别适合于肝细胞组织的培养和生长，但力学性能较差且不容易成形；丝素蛋白薄膜具有良好的力学性能，可用于构建三维结构，但亲水性差，不利于细胞贴附^[29-32]。李骁等^[33]将肝细胞与水凝胶混合形成细胞与基质材料混合物，然后利用具有三维结构的丝素蛋白薄膜与水凝胶细胞混合物有序结合，形成具有三维内部结构的支架与细胞复合体，用于体外培养或体内植入。水凝胶采用胶原蛋白混合肝脏细胞之后热交联形成，避免了化学交联对细胞不良影响的可能性，丝素蛋白立体薄膜通过快速成型和微复形技术制造。该方法既保证了支架具有可控稳定的三维结构又为肝细胞提供了良好的微生长环境，为人工制造肝组织提供了物质基础。在肿瘤及相伴血管生长过程中，微环境中的多种理化因素协同地发挥着重要作用。

2.1.3 其他支架材料琼脂糖是一种来源丰富、成本低廉、具有良好生物相容性的天然高分子材料，具有生物安全性和可降解性，利用其凝胶化现象可制成形状可塑的具有三维网络结构的凝胶。与其他天然材料相比，琼脂糖凝胶在机械性能上具有一定优势，如抗拉伸/压缩性、黏弹性、流变性等，但其必须与其他材料复合或者选用适宜的定型方式制成组织工程支架，以提高支架的组织相容性。海藻酸钠水凝胶具有与真皮基质成分蛋白多糖类似的结构，是较为理想的成纤维细胞培养材料。朱家源等^[34]利用碳化二亚胺作为催化剂、乙二胺作为交联剂制备新型海藻酸盐水凝胶支架材料，结果证实新型海藻酸盐组织工程真皮支架克服了传统以钙离子作为交联剂的诸多缺点，能够作为成纤维细胞的三维培养系统。典型的自组装短肽在水中可形成稳定的β-sheet二级结构，在生理性环境下则能够形成稳定的纳米纤维，可进一步形成含水量达99%的水凝胶，具有高纯度、可降解及无免疫反应等突出优点，能模拟生物体内的三维基质环境。聚乳酸具有良好的生物相容性、优异的力学性能和可控的降解速率，因此被广泛用作组织工程支架材料和细胞培养微载体等。但是，由于聚乳酸材料本身存在疏水性、表面能低、表面缺乏细胞识别位点等固有缺点，影响了细胞在微载体上的黏附、增殖和分泌基质，因此改善材料的细胞相容性十分必要。张超等^[35]研究无水乙醇对三维多孔聚乳酸支架材料亲水性能的改善作用，结果显示无水乙醇处理后，多孔聚乳酸支架吸附水的能力明显增加，所复合活性蛋白在支架材料内部的分布更加合理，说明无水乙醇能够迅速提高三维多孔聚乳酸支架材料的整体亲水性能，在组织工程研究中有利于材料支架和细胞或生长因子的复合。

2.2 三维细胞培养技术在肿瘤组织工程中的应用三维培养被用于肿瘤侵袭前细胞模型的构建，进一步拓展了其在肿瘤组织工程研究中的应用。近年来众多实验研究表明，培养在三维环境中的细胞，其基因表达模式和生物学活动更接近生命有机体。最近，三维细胞培养由于其独特的优点在肿瘤细胞中也有广泛应用，目前三维细胞培养方法不仅可以用来研究微环境对肿瘤细胞动力学和细胞变化的影响，而且还可用于寻找癌细胞形成的相关通路及监测癌细胞对抗癌药物的应答等^[36-38]。三维细胞培养器及培养方法可高度模拟体内肿瘤生理环境，用来检测筛选新型抗肿瘤药物的效果或检测肿瘤细胞对不同抗肿瘤药物敏感性，考虑了肿瘤细胞的营养供应、代谢废物排除、血管及血管内皮细胞的因素，接近于体内肿瘤的生长环境，进一步将体外肿瘤细胞生理环境大幅度地接近体内环境，这种新的技术将使检测筛选新型抗肿瘤药物和肿瘤细胞药敏试验提升到一个新的高度。

肿瘤患者生存率低，主要原因是有肿瘤干细胞存在而导致肿瘤的耐药、复发。肿瘤干细胞与肿瘤的转移、抗辐射和耐药密切相关，因此，筛选靶向治疗肿瘤干细胞的有效药物，对根治该类恶性肿瘤很有必要。谷峰等^[39]认为肿瘤原代细胞三维立体培养法成功率高、适用范围广、所需时间短、检测药物种类多，通过筛选敏感药物对临床用药进行指导，对于实现肿瘤的个体性化疗是一项十分有意义的检测方法。已有研究表明，乳腺癌干细胞会对乳腺癌的发生、转移等产生较大影响。通过模拟肿瘤微环境，可更好地对乳腺癌干细胞增殖与分化情况进行分析。陈峻崧等^[40]将普通二维细胞培养与卵巢癌肿瘤干细胞体外三维培养模型对比，探讨符合体内环境的三维培养条件，研究肿瘤干细胞生长、耐药等影响因素及机制。结果表明，与二维培养相比，三维培养卵巢癌HO8910细胞系中CD44⁺CD117⁺CSCs表现出明显的耐药性，表明BME基质胶三维培养模型可作为靶向治疗肿瘤干细胞药物筛选的理想体外模型。

肿瘤的生长依赖于血管新生，肿瘤血管生成的研究主要是观察肿瘤组织内微血管的形态与功能，阐明肿瘤诱发血管新生的机制及血管生成与肿瘤发生、发展的关系，这些研究对指导肿瘤的诊断、治疗及判断预后有重要意义。赵静等^[41]证实肝癌细胞具有进行自身变形并与胶原蛋白相互作用，形成血管样通道的能力。肿瘤细胞可通过血管生成拟态结构获得血液供应。孟立祥等^[42]研究结果说明，肝癌细胞具有自身变形形成血管样结构的能力，肿瘤细胞可通过血管生成拟态结构获得充足的血液供应。有实验发现，血管内皮生长因子α能促进卵巢癌细胞系血管生成拟态的形成，明显增强卵巢癌细胞侵袭和迁移的能力^[43]。国内外目前用于抗肿瘤研究的血管新生模型，细胞模型包括大分子基质细胞培养模型、cytodex3血管新生模型；组织模型则为各种动物的主动脉或静脉血管新生模型；整体模型包括家兔角膜血管新生模型、鸡胚尿囊膜血管新生模型、聚合物植入模型、斑马鱼或水蛭血管新生模型。

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引言

体内细胞生活在三维环境中，细胞在三维环境中与周围的细胞外基质、其他细胞相互作用，接受各种信号，指导其增殖、分化或迁移等行为。细胞培养技术是现代生物科学中发展十分迅速的一项实验技术，在生物科学与医学工程领域已得到广泛应用^[1-3]。由于生物体的复杂性及技术的限制，多年来人们对细胞行为的研究通常是把细胞从整体中分割开来，研究其在二维环境中的行为和功能，利用这种简化的模型得到了对细胞的基本认识，因而对细胞生物学的理解都是基于体外二维培养条件下进行的研究。近年来，随着材料科学、细胞生物学及生物反应器设计的发展，三维培养技术逐渐成为细胞培养领域研究的热点。该项技术有利于在体外构建与各类组织、器官相应的细胞三维生长类似物，因此，对组织工程学和临床应用都有重要意义。三维细胞培养技术是指将细胞培养于具有三维结构的载体，使细胞在载体的三维空间结构中迁移、生长，形成细胞-载体三维复合物，以利于更好地模拟体内细胞微环境，在组织工程等研究领域已成为标准模式^[4-5]。多年来，三维细胞培养在肿瘤研究中亦获得极大关注，开启了肿瘤研究的新模式。近年来，随着肿瘤工程学的发展，多种新型高分子聚合材料被应用于肿瘤细胞的三维立体培养，三维培养技术逐渐成为肿瘤生物学领域研究的热点。而随着三维细胞培养技术在肿瘤研究中的广泛应用，其已成为研究肿瘤细胞恶性表型、细胞与细胞外基质信号传递不可或缺的有力工具^[6-7]。有关三维细胞培养在肿瘤休眠、侵袭及转移中的研究进展很快，且研究内容更加广泛和深入。

三维细胞培养基质或支架为细胞培养提供了生长环境。三维细胞材料有几种主要的类型，包括来自天然材料的水凝胶支架，如细胞外基质胶原蛋白。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，具有良好的生物相容性和可降解性，一定的机械支撑强度和较高的可塑性，免疫原性较低，广泛分布在哺乳动物体内。基于以上这些优点，针对不同用途，研究者将胶原蛋白制作成无序和有序的三维支架材料，应用于肿瘤细胞三维培养。三维细胞培养中所使用的第二种类型支架是合成的水凝胶，有时也包括仿生肽，它们可增强整合素的结合。其他类型的人造支架是来自组织培养的塑料，甚至是可生物降解的塑料。因此，选择最好的三维细胞培养支架材料也是成功过渡的一个关键因素^[8-10]。

肿瘤的发生与进展始终伴随着与微环境之间的相互作用，微环境中诸多的生物、物理和化学因素调控了肿瘤最终的命运与转归。肿瘤在适应和利用微环境的同时，也会对微环境进行结构与功能的重塑。二维细胞培养是研究肿瘤细胞生物学的常用方法，但在二维培养体系下，传统的二维细胞培养体外模型及动物整体模型无法很好地模拟肿瘤与微环境之间复杂的生物事件，肿瘤细胞在二维条件下培养并不能有效展现体内肿瘤特征。近年越来越多的证据表明，与传统二维细胞培养相比，三维细胞培既可模拟体内细胞的微环境又可体现细胞培养的直观和条件可控的优势，所以三维培养为肿瘤研究提供了大量极具价值的发现。目前三维培养在肿瘤研究中占显著地位，其为深入研究肿瘤的生长、血管生成、休眠、侵袭和转移提供良好的平台^[11-12]，不仅使研究者更深刻的理解细胞分化、组织形成、内环境的稳定性在肿瘤研究中的重要性，而且填补了单层培养与动物实验之间的鸿沟，在不丧失体内环境的情况下，进行单一过程的研究。基于三维细胞培养的组织工程肿瘤实验体系能够在一定范围内，模拟肿瘤细胞在体生长状态，有望作为二维培养模型和动物整体模型之间的桥梁，成为组织工程肿瘤的基础及应用研究的重要组成部分。三维细胞培养的相关研究为更加准确了解体内细胞行为和生理调节机制提供了条件。

加强三维细胞培养系统的稳定性及可重复性的关键因素在于支架材料的选择，所选用的生物材料应具有良好的生物相容性和细胞亲和性，有利于细胞在生物材料表面的黏附、铺展和增殖，且应具有良好的温度敏感性，可以很好地模似体内环境，使三维培养条件下细胞的生理行为与人体生理环境接近。文章论述了几种常用的支架材料，有关仿生支架材料的研究还有更广阔的空间。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

讨论

3 结论 Conclusion

三维相对于二维细胞培养的优势非常明显，更接近细胞的体内状态；能够提高细胞因子、抗体及其他生物分子等的产量；能够改进细胞培养效率，细胞在三维环境中比在二维环境中生长更健康；实验数据更可靠，如基因表达谱、细胞活动等与体内研究的数据更吻合；能够降低新药研发的成本和周期；可替代一部分动物实验，而且在三维细胞培养系统中，可使用人类细胞作为研究对象，而不像动物实验那样，研究对象是动物细胞。肿瘤细胞三维培养由于其可模拟体内实体瘤的生长状态和微环境，更好地维持形态、结构和功能的特征，已被广泛应用于肿瘤生物学研究的各个方面。

三维支架材料的选择和应用是三维技术的关键之一。迄今为止，支架材料如胶原凝胶、明胶海绵、琼脂糖、壳聚糖、脱钙骨基质等尽管能为种子细胞提供三维空间环境，却无法提供类似细胞外基质的微环境，使种子细胞的生长及增殖受到影响，分泌Ⅱ型胶原和糖胺聚糖等细胞外基质的能力明显下降。而支架材料当中，仿生支架材料因其创伤小、可塑性强而逐渐显示出其独特的优越性^[44-45]。在三维培养条件下，肿瘤细胞上调了促血管发生生长因子的分泌量，这一特性同体内肿瘤的血管发生正相关。然而由于目前常用的三维模型耗时、缺乏重复性，因此微型的易于操作的三维培养模式相继出现。这种小型化三维培养技术的发展为癌症生物学、组织工程以及药物或基因筛选提供了—个平台。数学模型与三维技术的结合也得到越来越多的应用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

三维细胞培养生物材料及其在肿瘤组织工程研究中的应用

Three-dimensional scaffold materials for cell culture and their application in tumor tissue engineering

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